Javascript е моментално оневозможен во вашиот прелистувач.Кога javascript е оневозможен, некои функции на оваа веб-локација нема да работат.
Хавиер Фидалго, * Пјер-Антоан Деглесне, * Родриго Аројо, * Лилијан Сепулведа, * Евгенија Ранева, Филип Депре Одделот за наука, Skin Tech Pharma Group, Кастело Д'Емпури, Каталонија, Шпанија * Овие автори имаат извесен увид во ова дело Позадина на придонесот: Хијалуронската киселина (ХА) е природен полисахарид кој се користи во производството на дермални полнила за естетски цели.Бидејќи има полуживот од неколку дена во човечките ткива, дермалните филери базирани на HA се хемиски модифицирани за да го продолжат својот животен век во телото.Најчестата модификација во комерцијалните полнила базирани на HA е употребата на 1,4-бутанедиол диглицидил етер (BDDE) како средство за вкрстено поврзување за вкрстено поврзување на HA синџирите.Резидуалниот или нереагиран BDDE се смета за нетоксичен на <2 делови на милион (ppm);затоа, резидуалниот BDDE во финалниот дермален филер мора да се квантифицира за да се обезбеди безбедност на пациентот.Материјали и методи: Оваа студија го опишува откривањето и карактеризирањето на нуспроизвод од реакцијата на вкрстено поврзување помеѓу BDDE и HA под алкални услови со комбинирање на течна хроматографија и масена спектрометрија (LC-MS).Резултати: По различни анализи, беше откриено дека алкалните услови и високата температура користени за дезинфекција на хидрогелот HA-BDDE го промовираат формирањето на овој нов нуспроизвод, соединението „како пропилен гликол“.LC-MS анализата потврди дека нус-производот има иста моноизотопска маса како BDDE, различно време на задржување (tR) и различен режим на апсорпција на УВ (λ=200 nm).За разлика од BDDE, во LC-MS анализата беше забележано дека при исти услови на мерење, овој нуспроизвод има повисока стапка на детекција на 200 nm.Заклучок: Овие резултати покажуваат дека нема епоксид во структурата на ова ново соединение.Дискусијата е отворена за да се процени ризикот од овој нов нуспроизвод пронајден во производството на HA-BDDE хидрогел (HA дермален филер) за комерцијални цели.Клучни зборови: хијалуронска киселина, HA дермален филер, вкрстено поврзана хијалуронска киселина, BDDE, LC-MS анализа, BDDE нуспроизвод.
Филерите базирани на хијалуронска киселина (ХА) се најчестите и најпопуларните дермални филери кои се користат за козметички цели.1 Овој дермален филер е хидрогел, обично составен од >95% вода и 0,5-3% HA, што им дава структура слична на гел.2 HA е полисахарид и главната компонента на екстрацелуларната матрица на 'рбетниците.Една од состојките.Се состои од (1,4)-глукуронска киселина-β (1,3)-N-ацетилглукозамин (GlcNAc) повторувачки дисахаридни единици поврзани со гликозидни врски.Оваа шема на дисахариди е иста кај сите организми.Во споредба со некои полнила базирани на протеини (како што е колаген), ова својство го прави HA високо биокомпатибилна молекула.Овие полнила може да покажат специфичност на аминокиселинската секвенца што може да се препознае од имунолошкиот систем на пациентот.
Кога се користи како дермален филер, главното ограничување на HA е неговиот брз промет во ткивата поради присуството на специфична фамилија на ензими наречени хијалуронидази.Досега, опишани се неколку хемиски модификации во структурата на HA за да се зголеми полуживотот на HA во ткивата.3 Повеќето од овие модификации се обидуваат да го намалат пристапот на хијалуронидазата до полисахаридните полимери со вкрстено поврзување на HA синџири.Затоа, поради формирањето на мостови и меѓумолекуларните ковалентни врски помеѓу структурата на HA и средството за вкрстено поврзување, вкрстено поврзаниот HA хидрогел произведува повеќе производи за разградување на ензимите од природниот HA.4-6
Досега, хемиските агенси за вкрстено поврзување што се користат за производство на вкрстено поврзан HA вклучуваат метакриламид, 7 хидразид, 8 карбодиимид, 9 дивинил сулфон, 1,4-бутанедиол диглицидил етер (BDDE) и поли(етилен гликол) диглицидил етер.10,11 BDDE е моментално најчесто користениот агенс за вкрстено поврзување.Иако овие типови на хидрогели се докажани како безбедни со децении, агенсите за вкрстено поврзување што се користат се реактивни реагенси кои можат да бидат цитотоксични и, во некои случаи, мутагени.12 Затоа, нивната резидуална содржина во финалниот хидрогел мора да биде висока.BDDE се смета за безбеден кога резидуалната концентрација е помала од 2 делови на милион (ppm).4
Постојат неколку методи за откривање на концентрацијата на BDDE со низок остаток, степенот на вкрстено поврзување и позицијата на замена во HA хидрогелите, како што се гасната хроматографија, хроматографијата со исклучување на големината поврзана со масена спектрометрија (MS), методите за мерење на флуоресценција на нуклеарна магнетна резонанца (NMR) и Течна хроматографија со високи перформанси (HPLC) поврзана со диодна низа.13-17 Оваа студија го опишува откривањето и карактеризирањето на нуспроизвод во финалниот вкрстено поврзан HA хидрогел произведен од реакцијата на BDDE и HA под алкални услови.HPLC и течна хроматографија-масена спектрометрија (LC-MS анализа).Бидејќи токсичноста на овој нуспроизвод на BDDE е непозната, препорачуваме квантификацијата на неговите остатоци да се определи на сличен начин како методот што обично се изведува на BDDE во финалниот производ.
Добиената натриумова сол на HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) има молекуларна тежина од ~ 1.368.000 Da (Метод Лорент) 18 и внатрешна вискозност од 2,20 m3/kg.За реакцијата на вкрстено поврзување, BDDE (≥95%) беше купен од Sigma-Oldrich Co. (Сент Луис, Модератор, САД).Солен раствор со фосфат пуфер со pH 7,4 беше купен од компанијата Сигма-Олдрич.Сите растворувачи, ацетонитрил и вода користени во LC-MS анализата се купени од квалитет на HPLC.Мравја киселина (98%) се купува како реагенс.
Сите експерименти беа изведени на UPLC Acquity систем (Waters, Milford, MA, USA) и поврзани со троен четириполен масен спектрометар API 3000 опремен со извор на јонизација со електроспреј (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Синтезата на вкрстено поврзани HA хидрогели започна со додавање на 198 mg BDDE во 10% (w/w) раствор на натриум хијалуронат (NaHA) во присуство на 1% алкали (натриум хидроксид, NaOH).Конечната концентрација на BDDE во реакционата смеса беше 9,9 mg/mL (0,049 mM).Потоа, реакционата смеса беше темелно измешана и хомогенизирана и оставена да продолжи на 45°C 4 часа.19 рН на реакцијата се одржува на ~ 12.
Потоа, реакционата смеса беше измиена со вода, а финалниот хидрогел HA-BDDE беше филтриран и разреден со PBS пуфер за да се постигне концентрација на HA од 10 до 25 mg/mL и конечна pH вредност од 7,4.Со цел да се стерилизираат произведените вкрстено поврзани HA хидрогели, сите овие хидрогели се автоклавираат (120°C за 20 минути).Прочистениот BDDE-HA хидрогел се чува на 4°C до анализа.
За да се анализира BDDE присутен во вкрстено поврзаниот HA производ, примерок од 240 mg беше измерен и внесен во централната дупка (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, САД; волумен 0,5 mL) и центрифугиран на 10.000 вртежи во минута на собна температура 10 минута.Беа собрани и анализирани вкупно 20 µL течност за влечење.
За да се анализира BDDE стандардот (Sigma-Aldrich Co) под алкални услови (1%, 0,1% и 0,01% NaOH), доколку се исполнети следните услови, течниот примерок е 1:10, 1:100 или до 1:1.000.000 Доколку е потребно, користете MilliQ дејонизирана вода за анализа.
За почетните материјали користени во реакцијата на вкрстено поврзување (HA 2%, H2O, 1% NaOH и 0,049 mM BDDE), 1 mL од секој примерок подготвен од овие материјали беше анализиран со користење на истите услови за анализа.
За да се одреди специфичноста на врвовите што се појавуваат во јонската карта, 10 µL од 100 ppb BDDE стандарден раствор (Sigma-Aldrich Co) беа додадени на примерокот од 20 µL.Во овој случај, конечната концентрација на стандардот во секој примерок е 37 ppb.
Прво, подгответе го залихите раствор на BDDE со концентрација од 11.000 mg/L (11.000 ppm) со разредување на 10 μL стандарден BDDE (Sigma-Aldrich Co) со 990 μL MilliQ вода (густина 1,1 g/mL).Користете го овој раствор за да подготвите раствор од 110 µg/L (110 ppb) BDDE како средно стандардно разредување.Потоа, користете средно BDDE стандарден разредувач (110 ppb) за да ја подготвите стандардната крива со разредување на средно разредувачот неколку пати за да ја постигнете саканата концентрација од 75, 50, 25, 10 и 1 ppb.Како што е прикажано на слика 1, откриено е дека стандардната крива BDDE од 1,1 до 110 ppb има добра линеарност (R2>0,99).Стандардната крива беше повторена во четири независни експерименти.
Слика 1 BDDE стандардна калибрациона крива добиена со LC-MS анализа, во која е забележана добра корелација (R2>0,99).
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија.
Со цел да се идентификуваат и квантифицираат BDDE стандардите присутни во вкрстено поврзаниот HA и стандардите BDDE во основниот раствор, користена е LC-MS анализа.
Хроматографското раздвојување беше постигнато на LUNA 2,5 µm C18(2)-HST колона (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) и се чуваше на собна температура (25°C) за време на анализата.Мобилната фаза се состои од ацетонитрил (растворувач А) и вода (растворувач Б) што содржи 0,1% мравја киселина.Мобилната фаза се елуира со градиентно елуирање.Градиентот е како што следува: 0 минути, 2% А;1 минута, 2% А;6 минути, 98% А;7 минути, 98% А;7,1 минути, 2% А;10 минути, 2% А. Времето на работа е 10 минути, а волуменот на инјектирање е 20 µL.Времето на задржување на BDDE е околу 3,48 минути (се движи од 3,43 до 4,14 минути врз основа на експерименти).Мобилната фаза беше испумпана со брзина на проток од 0,25 mL/min за LC-MS анализа.
За анализа и квантификација на BDDE со MS, системот UPLC (Waters) е комбиниран со API 3000 троен четириполен масен спектрометар (AB SCIEX) опремен со извор на јонизација со електропрскање, а анализата се изведува во режим на позитивен јонски режим (ESI+).
Според анализата на јонскиот фрагмент извршена на BDDE, фрагментот со најголем интензитет е утврден дека е фрагмент кој одговара на 129,1 Da (слика 6).Затоа, во режимот на повеќејонски мониторинг (MIM) за квантификација, конверзијата на масата (однос од маса до полнење [m/z]) на BDDE е 203,3/129,1 Da.Исто така, користи режим на целосно скенирање (FS) и режим на јонско скенирање на производи (PIS) за LC-MS анализа.
Со цел да се потврди специфичноста на методот, беше анализиран празен примерок (почетна мобилна фаза).Не е откриен сигнал во празната мостра со масовна конверзија од 203,3/129,1 Да.Во однос на повторливоста на експериментот, беа анализирани 10 стандардни инјекции од 55 ppb (во средината на кривата на калибрација), што резултираше со преостаната стандардна девијација (RSD) <5% (податоци не се прикажани).
Преостанатата содржина на BDDE беше квантифицирана во осум различни автоклавирани BDDE вкрстено поврзани HA хидрогели, што одговара на четири независни експерименти.Како што е опишано во делот „Материјали и методи“, квантификацијата се оценува со просечната вредност на регресивната крива на стандардното разредување BDDE, што одговара на уникатниот врв откриен при транзицијата на масата BDDE од 203,3/129,1 Da, со задржување време од 3,43 до 4,14 минути Не чека.Слика 2 покажува примерен хроматограм на референтниот стандард BDDE од 10 ppb.Табела 1 ја сумира резидуалната содржина на BDDE на осум различни хидрогели.Опсегот на вредности е од 1 до 2,46 ppb.Затоа, резидуалната концентрација на BDDE во примерокот е прифатлива за човечка употреба (<2 ppm).
Слика 2 Јонски хроматограм од 10 ppb BDDE референтен стандард (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) транзиција добиен со LC-MS анализа од 203,30/129,10 Da (во позитивен MRM режим).
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции;MS, маса;m/z, однос маса-полнење.
Забелешка: Примероците 1-8 се автоклавирани BDDE вкрстено поврзани HA хидрогели.Пријавени се и преостанатата количина на BDDE во хидрогелот и врвот на времето на задржување на BDDE.Конечно, се известува и за постоење на нови врвови со различно време на задржување.
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;HA, хијалуронска киселина;МРМ, повеќекратно следење на реакции;tR, време на задржување;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;RRT, релативно време на задржување.
Изненадувачки, анализата на LC-MS јонскиот хроматограм покажа дека врз основа на сите анализирани примероци од автоклавирани вкрстено поврзани HA хидрогел, има дополнителен врв при пократкото време на задржување од 2,73 до 3,29 минути.На пример, Слика 3 го прикажува јонскиот хроматограм на вкрстено поврзан HA примерок, каде што се појавува дополнителен врв при различно време на задржување од приближно 2,71 минути.Набљудуваното релативно време на задржување (RRT) помеѓу новонабљудуваниот врв и врвот од BDDE беше откриено дека е 0,79 (Табела 1).Бидејќи знаеме дека новонабљудуваниот врв е помалку задржан во колоната C18 користена во анализата LC-MS, новиот врв може да одговара на пополарно соединение од BDDE.
Слика 3 Јонски хроматограм на вкрстено поврзан HA хидрогел примерок добиен со LC-MS (MRM масовна конверзија 203.3/129.0 Da).
Кратенки: HA, хијалуронска киселина;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции;RRT, релативно време на задржување;tR, време на задржување.
Со цел да се исклучи можноста дека новите забележани врвови може да бидат загадувачи првично присутни во користените суровини, овие суровини беа исто така анализирани со користење на истиот метод на анализа LC-MS.Анализираните почетни материјали вклучуваат вода, 2% NaHA во вода, 1% NaOH во вода и BDDE во иста концентрација што се користи во реакцијата на вкрстено поврзување.Јонскиот хроматограм на употребениот почетен материјал не покажа никакво соединение или врв, а неговото време на задржување одговара на новиот забележан врв.Овој факт ја отфрла идејата дека не само почетниот материјал може да содржи какви било соединенија или супстанци кои може да пречат во постапката за анализа, туку нема знаци за можна вкрстена контаминација со други лабораториски производи.Вредностите на концентрацијата добиени по LC-MS анализата на BDDE и новите врвови се прикажани во Табела 2 (примероци 1-4) и јонски хроматограм на Слика 4.
Забелешка: Примероците 1-4 одговараат на суровините што се користат за производство на автоклавирани BDDE вкрстено поврзани HA хидрогели.Овие примероци не беа автоклавирани.
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;HA, хијалуронска киселина;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции.
Слика 4 одговара на LC-MS хроматограмот на примерок од суровината што се користи во реакцијата на вкрстено поврзување на HA и BDDE.
Забелешка: Сите овие се мерат во иста концентрација и однос што се користат за спроведување на реакцијата на вкрстено поврзување.Броевите за суровините анализирани со хроматограмот одговараат на: (1) вода, (2) 2% HA воден раствор, (3) 1% воден раствор на NaOH.LC-MS анализа се врши за масовна конверзија од 203,30/129,10 Da (во позитивен MRM режим).
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;HA, хијалуронска киселина;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции.
Проучени се условите кои довеле до формирање на нови врвови.Со цел да се проучи како условите на реакција користени за производство на вкрстено поврзан HA хидрогел влијаат на реактивноста на средството за вкрстено поврзување BDDE, што доведува до формирање на нови врвови (можни нуспроизводи), беа извршени различни мерења.Во овие определби, го проучувавме и анализиравме финалниот BDDE вкрстено поврзување, кој беше третиран со различни концентрации на NaOH (0%, 1%, 0,1% и 0,01%) во воден медиум, проследено со или без автоклавирање.Постапката на бактерии за симулирање на истите услови е иста како и методот што се користи за производство на вкрстено поврзан HA хидрогел.Како што е опишано во делот „Материјали и методи“, масовната транзиција на примерокот беше анализирана со LC-MS до 203.30/129.10 Da.BDDE и концентрацијата на новиот пик се пресметани, а резултатите се прикажани во Табела 3. Не се откриени нови пикови во примероците кои не биле автоклавирани, без оглед на присуството на NaOH во растворот (примероци 1-4, Табела 3).За автоклавирани примероци, новите врвови се откриваат само во присуство на NaOH во растворот, а формирањето на врвот изгледа дека зависи од концентрацијата на NaOH во растворот (примероци 5-8, Табела 3) (RRT = 0,79).Слика 5 покажува пример на јонски хроматограм, кој покажува два автоклавирани примероци во присуство или отсуство на NAOH.
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции.
Забелешка: Горниот хроматограм: примерокот беше третиран со 0,1% воден раствор на NaOH и автоклавен (120°C за 20 минути).Долен хроматограм: примерокот не беше третиран со NaOH, туку автоклавен под истите услови.Масовната конверзија на 203.30/129.10 Da (во позитивен MRM режим) беше анализирана со LC-MS.
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции.
Во сите автоклавирани примероци, со или без NaOH, концентрацијата на BDDE беше значително намалена (до 16,6 пати) (примероци 5-8, Табела 2).Намалувањето на концентрацијата на BDDE може да се должи на фактот дека на високи температури, водата може да дејствува како основа (нуклеофил) за да го отвори епоксидниот прстен на BDDE за да формира соединение од 1,2-диол.Моноизотопскиот квалитет на ова соединение е различен од оној на BDDE и затоа нема да биде засегнат.LC-MS детектира масовно поместување од 203,30/129,10 Да.
Конечно, овие експерименти покажуваат дека генерирањето на нови врвови зависи од присуството на BDDE, NAOH и процесот на автоклавирање, но нема никаква врска со HA.
Новиот врв пронајден при време на задржување од приближно 2,71 минути потоа се карактеризира со LC-MS.За таа цел, BDDE (9,9 mg/mL) се инкубира во 1% воден раствор на NaOH и се автоклавира.Во Табела 4, карактеристиките на новиот врв се споредуваат со познатиот референтен врв BDDE (време на задржување приближно 3,47 минути).Врз основа на анализата на јонска фрагментација на двата пикови, може да се заклучи дека пикот со време на задржување од 2,72 минути ги покажува истите фрагменти како врвот BDDE, но со различен интензитет (слика 6).За врвот што одговара на времето на задржување (PIS) од 2,72 минути, беше забележан поинтензивен врв по фрагментација на маса од 147 Da.При концентрацијата на BDDE (9,9 mg/mL) што се користи при ова определување, беа забележани и различни режими на апсорпција (UV, λ=200 nm) во ултравиолетовиот спектар по хроматографското одвојување (слика 7).Врвот со време на задржување од 2,71 минути е сè уште видлив на 200 nm, додека врвот BDDE не може да се забележи во хроматограмот под истите услови.
Табела 4 Резултати од карактеризација на новиот врв со време на задржување од околу 2,71 минути и врвот BDDE со време на задржување од 3,47 минути
Забелешка: За да се добијат овие резултати, LC-MS и HPLC анализи (MRM и PIS) беа извршени на двата врва.За HPLC анализа се користи детекција на УВ со бранова должина од 200 nm.
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;HPLC, течна хроматографија со високи перформанси;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции;m/z, однос маса-полнење;PIS, производ Јонско скенирање;ултравиолетова светлина, ултравиолетова светлина.
Забелешка: Масовните фрагменти се добиваат со LC-MS анализа (PIS).Горен хроматограм: масен спектар на фрагменти од стандардниот примерок BDDE.Долен хроматограм: Масовниот спектар на откриениот нов врв (RRT поврзан со врвот BDDE е 0,79).BDDE беше обработен во 1% раствор на NaOH и автоклавен.
Кратенки: BDDE, 1,4-бутанедиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, повеќекратно следење на реакции;PIS, производ јонско скенирање;RRT, релативно време на задржување.
Слика 7.
Во сите произведени вкрстено поврзани HA хидрогели, беше забележано дека резидуалната концентрација на BDDE по квантификацијата на LC-MS беше <2 ppm, но во анализата се појави нов непознат врв.Овој нов врв не се совпаѓа со стандардниот производ BDDE.Стандардниот производ BDDE, исто така, ја помина истата анализа на конверзија на квалитет (MRM конверзија 203.30/129.10 Da) во позитивен MRM режим.Општо земено, други аналитички методи како што е хроматографијата се користат како гранични тестови за откривање на BDDE во хидрогелите, но максималната граница за откривање (LOD) е малку пониска од 2 ppm.Од друга страна, досега, NMR и MS се користени за карактеризирање на степенот на вкрстено поврзување и/или модификација на HA во фрагментите на шеќерна единица на вкрстено поврзани HA производи.Целта на овие техники никогаш не била да се измери преостанатата детекција на BDDE при толку ниски концентрации како што ја опишуваме во овој напис (LOD на нашиот LC-MS метод = 10 ppb).
Време на објавување: Сеп-01-2021 година